Nécessité d'avoir des virus pour l'ingénierie génétique des cellules T dans l'édition de gènes

Avec une technique plus rapide, moins chère et plus précise, les auteurs disent qu'il est «à la course» vers de nouvelles thérapies cellulaires

Dans une réalisation qui a des implications significatives pour la recherche, la médecine et l'industrie, les scientifiques de l'UC San Francisco ont génétiquement reprogrammé les cellules immunitaires humaines connues sous le nom de cellules T sans utiliser de virus pour insérer l'ADN. Les chercheurs espèrent que leur technique – une approche rapide, polyvalente et économique utilisant la technologie d'édition de gènes CRISPR – sera largement adoptée dans le domaine émergent de la thérapie cellulaire, accélérant le développement de traitements nouveaux et plus sûrs pour le cancer, l'auto-immunité et d'autres maladies, y compris les maladies héréditaires rares.

L'équipe de recherche a créé des guides CRISPR qui feraient en sorte que les protéines fluorescentes vertes ne soient exprimées que dans certaines localisations et structures cellulaires. Crédit: Le laboratoire d'Alex Marson.

La nouvelle méthode, décrite dans le numéro du 11 juillet 2018 de Nature offre un système robuste de "couper-coller" moléculaire pour réécrire les séquences du génome dans les cellules T humaines. Il repose sur l'électroporation, un processus dans lequel un champ électrique est appliqué aux cellules pour rendre leurs membranes temporairement plus perméables. Après avoir expérimenté des milliers de variables au cours d'une année, les chercheurs de l'UCSF ont découvert que lorsque certaines quantités de cellules T, ADN et les «ciseaux» CRISPR sont mélangés ensemble, puis exposés à un champ électrique approprié, les cellules T prennent dans ces éléments et d'intégrer des séquences génétiques spécifiques précisément sur le site d'une coupe programmée CRISPR dans le génome.

"C'est une méthode rapide et flexible qui peut être utilisée pour altérer, améliorer et reprogrammer les lymphocytes T afin de leur donner la spécificité que nous voulons pour détruire le cancer, reconnaître les infections ou réduire la réponse immunitaire excessive. vu dans la maladie auto-immune », a déclaré Alex Marson UCSF MD, PhD, professeur agrégé de microbiologie et d'immunologie, un membre du UCSF Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center et auteur principal de la nouvelle étude. "Maintenant, nous sommes hors des courses sur tous ces fronts."

Mais tout aussi important que la rapidité et la facilité d'utilisation de cette nouvelle technique, dit Marson, également directeur scientifique de la biomédecine à l'Institut de génomique innovante, cette approche permet d'insérer des étendues substantielles d'ADN dans les lymphocytes T , qui peut doter les cellules de nouvelles propriétés puissantes. Les membres du laboratoire de Marson ont eu quelques succès en utilisant l'électroporation et CRISPR pour insérer des fragments de matériel génétique dans les cellules T, mais jusqu'à présent, de nombreuses tentatives de nombreux chercheurs de placer de longues séquences d'ADN dans les lymphocytes T mourir, conduisant le plus à croire que de grandes séquences d'ADN sont excessivement toxiques pour les cellules T.

Pour démontrer la polyvalence et la puissance de la nouvelle méthode, les chercheurs l'ont utilisée pour réparer une mutation génétique causant des maladies chez les enfants atteints d'une forme génétique rare d'auto-immunité, et ont également créé des cellules T personnalisées pour rechercher et tuer cellules de mélanome humain.

Les virus provoquent des infections en injectant leur propre matériel génétique à travers les membranes cellulaires. Depuis les années 1970, les scientifiques exploitent cette capacité, dépouillant les virus de leurs caractéristiques infectieuses et utilisant les «vecteurs viraux» pour transporter l'ADN dans les cellules. thérapie génique, et dans un exemple récent très médiatisé, pour créer les cellules CAR-T utilisées dans l'immunothérapie du cancer.

Les cellules T manipulées avec des virus sont maintenant approuvées par la Food and Drug Administration des Etats-Unis pour lutter contre certains types de leucémie et de lymphome. Mais la création de vecteurs viraux est un processus minutieux et coûteux, et une pénurie de vecteurs de qualité clinique a conduit à un goulot d'étranglement dans la fabrication des thérapies géniques et des thérapies cellulaires. Même lorsqu'ils sont disponibles, les vecteurs viraux sont loin d'être idéaux, car ils insèrent des gènes au hasard dans les génomes cellulaires, ce qui peut endommager les gènes sains existants ou laisser les gènes nouvellement introduits par les mécanismes régulateurs qui assurent le fonctionnement normal des cellules. Ces limitations, qui pourraient potentiellement conduire à des effets secondaires graves, ont été source de préoccupation à la fois dans la thérapie génique et les thérapies cellulaires telles que l'immunothérapie à base de CAR-T.

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"Il y a eu trente ans de travail pour essayer d'obtenir de nouveaux gènes dans les lymphocytes T", explique Theo Roth un étudiant qui poursuit des études doctorales et doctorales dans le cadre du programme de formation de scientifiques médicaux de l'UCSF. conçu et dirigé la nouvelle étude dans le laboratoire de Marson. "Maintenant, il ne devrait plus être nécessaire d'avoir six ou sept personnes dans un laboratoire travaillant avec des virus uniquement pour l'ingénierie des cellules T, et si nous commençons à voir des centaines de laboratoires d'ingénierie ces cellules au lieu de seulement quelques des séquences d'ADN complexes, nous allons essayer tellement plus de possibilités que cela accélérera de manière significative le développement des futures générations de thérapie cellulaire. "

Après presque une année d'essai et d'erreur, Roth a déterminé les rapports entre les populations de lymphocytes T, la quantité d'ADN et l'abondance de CRISPR qui, combinés avec un champ électrique fourni avec les paramètres appropriés, se traduiraient par édition précise des génomes des cellules T.

Pour valider ces résultats, Roth a dirigé CRISPR pour marquer un tableau de différentes protéines T avec protéine fluorescente verte (GFP), et le résultat était très spécifique, avec de très faibles niveaux d'effets "hors cible": chaque structure sous-cellulaire Les gabarits CRISPR-Cas9 de Roth avaient été conçus pour marquer avec le GFP – et aucun autre vert brillant au microscope.

Puis, dans des expériences complémentaires conçues pour prouver la promesse thérapeutique de la nouvelle technique, Roth, Marson et ses collègues ont montré comment il pourrait potentiellement être utilisé pour mobiliser les cellules T contre une maladie auto-immune ou un cancer .

Dans le premier exemple, Roth et ses collègues utilisaient des lymphocytes T fournis au laboratoire Marson par Kevan Herold, MD, de l'école de médecine de Yale. Les cellules provenaient de trois frères et sœurs atteints d'une maladie auto-immune rare et sévère jusqu'alors résistante au traitement. Le séquençage génomique avait montré que les cellules T chez ces enfants portaient des mutations dans un gène appelé IL2RA . Ce gène porte des instructions pour un récepteur de surface cellulaire essentiel pour le développement de cellules T régulatrices, ou Tregs, qui contrôlent les autres cellules immunitaires et empêchent l'auto-immunité.

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<figcaption> Jeu de tubes à essai dans le laboratoire d'Alex Marson <em> Crédit: Noah Berger. </em> </figcaption></figure>
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<p> Avec la technique CRISPR non-virale, l'équipe UCSF a été capable de réparer rapidement le défaut <i> IL2RA </i> dans les lymphocytes T des enfants, et de restaurer les signaux cellulaires qui avaient En thérapie CAR-T, les lymphocytes T qui ont été retirés du corps sont conçus pour améliorer leur capacité de lutte contre le cancer, puis retournés dans le corps pour cibler les tumeurs.Les chercheurs espèrent qu'une approche similaire pourrait être efficace pour le traitement des maladies auto-immunes dans lesquelles Tregs dysfonctionnement, comme celui observé chez les trois enfants avec les mutations <i> IL2RA </i>.
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<p> Dans une deuxième série d'expériences menées en collaboration avec Cristina Puig-Saus, PhD, et Antoni Ribas, MD, de l'Institut Parker pour l'immunothérapie du cancer à UCLA, les scientifiques ont complètement remplacé les récepteurs T dans une population de lymphocytes T humains normaux avec de nouveaux récepteurs qui ont été spécifiquement conçus pour rechercher un sous-type particulier de cellules de mélanome humain. Les cellules T sont les capteurs utilisés par les cellules pour détecter la maladie ou l'infection. Dans les boîtes de laboratoire, les cellules modifiées sont intégrées aux cellules de mélanome ciblées tout en ignorant les autres cellules, ce qui constitue un objectif majeur de la médecine de précision.
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Sans utiliser de virus, les chercheurs ont pu générer un grand nombre de cellules modifiées par CRISPR reprogrammées pour afficher le nouveau récepteur des lymphocytes T. Lorsqu'ils ont été transférés dans des souris implantées avec des tumeurs de mélanome humain, les cellules T humaines génétiquement modifiées sont allées au site de la tumeur et ont montré une activité anticancéreuse.

"Cette stratégie de remplacement du récepteur des cellules T peut être généralisée à tout récepteur des cellules T", a déclaré Marson, également membre de l'Institut Parker pour l'immunothérapie du cancer à l'UCSF et un Chan Zuckerberg Biohub Investigator. "Avec cette nouvelle technique, nous pouvons couper et coller dans un endroit précis, en réécrivant une page spécifique dans la séquence du génome."

Roth a déclaré que parce que la nouvelle technique permet de créer des lignées de cellules T personnalisées viables en un peu plus d'une semaine, il a déjà transformé l'environnement de recherche dans le laboratoire de Marson. Les idées d'expériences qui étaient auparavant jugées trop difficiles ou trop chères à cause des obstacles présentés par les vecteurs viraux sont maintenant mûres pour être étudiées. "Nous allons travailler sur 20 idées" folles ", a déclaré Roth," parce que nous pouvons créer des modèles CRISPR très rapidement, et dès que nous avons un modèle, nous pouvons l'obtenir dans les cellules T et les développer rapidement. "

Marson attribue le succès de la nouvelle méthode à la «persévérance absolue» de Roth face aux croyances répandues selon lesquelles les vecteurs viraux étaient nécessaires et que seuls de petits fragments d'ADN pouvaient être tolérés par les lymphocytes T. "Théo était convaincu que si nous pouvions trouver les bonnes conditions nous pourrions surmonter ces limitations perçues, et il a mis dans un effort herculéen pour tester des milliers de conditions différentes: le rapport du CRISPR à l'ADN; différentes façons de cultiver les cellules; différents courants électriques. En optimisant chacun de ces paramètres et en réunissant les meilleures conditions, il a pu voir ce résultat stupéfiant. "

Voir l'étude en ligne pour une liste complète des auteurs, ainsi que des informations sur le financement. Marson est cofondateur de Spotlight Therapeutics et conseille Juno Therapeutics et PACT Pharma. Le laboratoire Marson a reçu des financements sponsorisés pour Juno, Epinomics et Sanofi, ainsi qu'un don de Gilead Sciences. Roth, Puig-Saus, Eric Shifrut, Ph.D., Ribas et Marson sont des inventeurs de nouvelles demandes de brevet liées à cette recherche.

UC San Francisco (UCSF) est une université de premier plan vouée à la promotion de la santé dans le monde grâce à la recherche biomédicale avancée, aux études supérieures en sciences de la vie et à la santé. Il comprend les meilleures écoles supérieures de dentisterie, de médecine, de soins infirmiers et pharmacie, ainsi que UCSF Fresno, qui se consacre à l'amélioration de la santé dans la vallée de San Joaquin; une division des cycles supérieurs avec des programmes de renommée nationale en sciences fondamentales, biomédicales, translationnelles et de la population; et une entreprise de recherche biomédicale prééminente. Il comprend également UCSF Health, qui comprend trois hôpitaux de premier rang – UCSF Medical Center et UCSF Benioff hôpitaux pour enfants en San Francisco et Oakland ] – ainsi que l'hôpital et les cliniques psychiatriques de Langley Porter, les médecins d'enfants de l'UCSF Benioff et la pratique de la faculté de l'UCSF. UCSF Health a des affiliations avec des hôpitaux et des organismes de santé dans toute la région de la baie. Faculté UCSF fournissent également tous les soins médicaux à l'hôpital général public Zuckerberg San Francisco et Trauma Center, et le centre médical SF VA.

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